Nature 正刊丨神经肽信号调控T细胞分化

01摘要

T辅助1型（TH1）细胞和其他TH细胞之间的平衡对于抗病毒和抗肿瘤反应至关重要1,2,3，但如何实现这种平衡仍然知之甚少。在这里，我们解剖了TH1细胞在体外极化过程中以及急性病毒感染后体内分化过程中的动态调控。我们使用独特的TH1-TH2细胞二分培养系统鉴定了调节T辅助细胞分化的调节因子，并通过多种体外和体内CRISPR筛选系统地验证了它们的调节功能。我们发现，RAMP3是神经肽CGRP（降钙素基因相关肽）受体的一个组成部分，在TH1细胞命运决定中具有细胞内在作用。细胞外CGRP信号通过受体RAMP3–CALCRL限制TH2细胞的分化，但通过激活下游cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和激活转录因子3（ATF3）促进TH1细胞的分化。ATF3通过诱导TH1细胞分化的关键调节因子Stat1的表达促进TH1细胞的分化。病毒感染后，神经元产生的CGRP与T细胞上表达的RAMP3之间的相互作用增强了抗病毒IFNγ产生的TH1和CD8+T细胞反应，并及时控制了急性病毒感染。我们的研究确定了一种神经免疫回路，其中神经元在急性病毒感染期间通过产生神经肽CGRP参与T细胞命运的决定，CGRP作用于表达RAMP3的T细胞，诱导有效的抗病毒TH1细胞反应。

02图表简介

a、 TH1细胞体外分化过程中动态表达基因的相对表达。b、 时间体RNA-seq的PCA。c、 LCMV Armstrong感染期间CD4+T细胞scRNA-seq分析的实验设计示意图。UMAP，均匀流形近似和投影。d、 在Armstrong感染期间，CD4+T细胞中检测到八个具有不同表达模式的细胞簇（上图）。最后，使用Slingshot（方法）推导了微分轨迹。NK，自然杀伤细胞；TCMP，T中央记忆前体细胞；TFR、T卵泡调节细胞。e、 对应于部分d的每个细胞簇的所选标记的表达谱。

a、 在TH1-TH2二分条件下培养3天后，获得了相当比例的IFNγ+和IL-13+细胞。用IfngYFPIl13hCD4报告小鼠，在TH1-TH2二分条件下体外培养3天后，对IFNγ+、IL-13+和双阴性（DN）细胞进行分选。通过qPCR检测每个细胞群中TH1或TH2细胞特征基因相对于看家基因Hprt的相对表达。使用双尾Student t检验进行统计分析。数据为平均值±标准差，n=6个样本，来自≥3只小鼠。b、 TH1-TH2二分条件下的细胞在全局转录组水平上显示出三个主要的动态阶段。在TH1-TH2二分条件下，每4小时进行一次时间scRNA-seq，持续3天。在体外培养3天期间对所有收集的细胞进行UMAP包埋分析。单元格（点）根据收集时间点着色。c、 在TH1-TH2二分条件下收集的所有细胞中，Ifng和Il13之间存在排他性表达。d、 在TH1-TH2二分条件下收集的所有细胞中，TH1和TH2细胞程序之间存在排他性表达。e、 在TH1-TH2二分条件下，所有检测到的时间点上定义的细胞类型的百分比。f–h，在TH1-TH2二分条件下在多个时间点收集的细胞的伪时间分析。细胞由伪时间分数（f）、定义的细胞类型（g）和收集时间点（h）着色。i、 f部分假时间分析中分支基因的表达模式。

a、 混合基因筛选的实验设计。Rosa26-Cas9小鼠的幼稚CD4+或CD8+T细胞经抗CD3和抗CD28处理24小时后被激活，并用慢病毒sgRNA文库转导以进行体外扰动。转导的细胞用IL-2休息2天，然后用细胞因子（IL-12或IL-4）极化2天。使用嵌合免疫编辑系统，从免疫重组小鼠中分选编辑的幼稚CD4+T细胞，用于在LCMV-Armstrong感染期间用不同细胞因子进行离体细胞极化或体内细胞分化。细胞分化后，根据sgRNA测序标记基因的表达对不同的细胞群进行分类。ICC染色、细胞内细胞因子染色；IM，中级。b、 Stat4 sgRNAs或Tbx21 sgRNAs在分选细胞群中的动态分布。对数转换倍数变化（LFC）值表示log2[倍数变化]。直方图的密度显示了每个样本中所有检测到的sgRNA的分布。靶向Stat4或Tbx21的sgRNA以红色标记。，负面。c、 通过结合每个基因的三个sgRNA的delta log2[倍数变化]评分，用体外和离体筛选结果定义TH1细胞阳性或阴性调节因子。Ramp3（红色字体）用于下游功能分析。d、 采用体外基因扰动策略对顶级调节因子进行个体功能验证。使用双尾Student t检验进行统计分析。数据为平均值±标准差，n=6个样本，来自≥3只小鼠。

a、 CGRP促进TH1细胞分化，拮抗TH2细胞分化。TH1和TH2细胞在体外用CGRP分化。在第3天进行细胞内细胞因子染色。显示了代表性的流式细胞术（左）和定量（右）。在第2天使用LegendPlex分析分泌的细胞因子（右）。n=4.FSC，前向散射。b、 CGRP促进TH1细胞标志基因的表达。体外培养TH1细胞的TH1细胞特征富集图（GSEA 4.1.0）。NES，归一化富集评分。c、 CGRP/ADM对TH1分化的促进作用在Ramp3−/−T细胞中被消除。在体外TH1分化3天后检测IFNγ的表达，无论是否经过CGRP或ADM治疗。显示了代表性的流式细胞术（左）和定量（右）。n=3只小鼠。d、 在没有外源性CGRP治疗的情况下，Ramp3−/−T细胞在TH1分化方面没有缺陷。n=3只小鼠。e、 dbcAMP治疗概括了CGRP和ADM的作用。cAMP治疗显示出对TH1分化的剂量依赖性增强（上图）和对TH2分化的抑制（下图）。在第3天进行细胞内细胞因子染色。显示了代表性的流式细胞术（左）和定量（中）。对，在第2天使用LegendPlex测定法分析分泌的细胞因子。n=5-6.f，用CREB抑制剂666-15（50μM）治疗可以消除CGRP对TH1分化的增强作用。显示了代表性的流式细胞术（左）和定量（右）。n=5。使用双尾Student t检验进行统计分析。数据为平均值±标准差。对于a、e和f，n值表示从≥3只小鼠中汇集的样本。所示结果来自一个实验，代表了至少三个独立的实验。

03 参考文献
Liu Y , Qin Z , Yang X ,et al.High-Voltage Manganese Oxide Cathode with Two-Electron Transfer Enabled by a Phosphate Proton Reservoir for Aqueous Zinc Batteries[J]. 2022.

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