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HISAT 软件比对算法及性能简介

news 2025/5/16 8:03:07

HISAT（hierarchical indexing for spliced alignment of transcripts，利用分层索引对转录本进行剪切比对）使用两种索引方式进行比对：

全基因组索引，用于将 reads 锚定到基因组上；
大量局部索引（每个索引覆盖基因组 64 Kbp 区间），用于快速延伸及比对错配序列；

HISAT 将 RNA-seq 的 reads 分为 5 类：

完整的比对在单个外显子区内（M）；
比对到两个外显子区，且每个外显子区的比对长度 > 15 bp（2M_gt_15）；
比对到两个外显子区，且一个外显子区的比对长度为 8-15 bp（2M_8_15）；
比对到两个外显子区，且一个外显子区的比对长度为 1-7 bp（2M_1_7）；
比对到三个外显子区（gt_2M）；

fig 1

图 1 HISAT 将 RNA-seq 的 reads 分为 5 类

第 1、2、3 类 reads 的比对

HISAT 首先使用全局索引根据 read 的部分序列信息，将其定位到基因组上，一般会定位到一个或少数几个候选位置。然后，HISAT 使用局部索引对 read 的比对结果进行延伸，直至 read 全部比对到参考基因组上。除了第 1 类 reads 外（图 2a），其余 4 类 reads 在延伸过程中会出现大量的错配，算法需要将错配的短序列比对到基因组其他区间（图 2b）。第 3、4 类 reads 因为在一个外显子区域内的序列长度较短，在基因组上存在大量的候选位点。例如，8 bp 序列有 4⁸ = 65536 种可能性，3 Gbp 长度的基因组按照 8 bp 长度切割，产生 375,000,000 个片段，如果基因组由碱基随机排列而成，约 5722 个（375,000,000 / 65,536 = 5,722）片段的序列完全一致。传统的剪切比对算法使用全局索引查找错配短序列的候选位置（图 2，Global Search），然后算法在大量候选中筛选出最佳的比对位置。这类算法在比对过程中需要反复读取庞大的全局索引（如人类基因组全局索引约为 913 MB），较为耗时。为了快速且准确的比对，HISAT 将错配的序列仅在局部索引（覆盖 64 Kbp 范围，索引大小 24 KB）内进行比对（图 2c，Local Search）。以人类基因组为例，64 Kbp 的局部索引将包含 90.4% 的内含子。当错配序列无法在局部索引内被合理比对时，HISAT 则认为遇到了长内含子，会将两个或多个连续的局部索引合并后再进行比对，直至预设的上限（500 Kbp）。达到局部索引长度的上限但仍未比对上时，HISAT 则判定该 read 无法比对到参考基因组上。此外，HISAT 还优化了 reads 比对的延伸步骤，当 reads 的前 28 bp 精确比对到基因组唯一位置时，HISAT 停止全局搜索，直接比较剩余序列和相应的基因组序列来延伸比对结果，直到不匹配为止（图 2，Extension）。如果错配序列较长，HISAT 局部搜索 8 bp 后将再次调用延伸算法（图 2d）。

fig 2

图 2 HISAT 处理第 1、2、3 类 reads

第 4 类 reads 的比对

如果错配序列非常短（1-7 bp），序列在局部索引内也可能与多个位置匹配，正确比对较为困难。HISAT 选择利用剪切位点信息移除内含子，然后进行比对。具体而言，HISAT 第一遍运行完成对第 1、2、3 类 reads 的比对，第 4 类 reads 因为候选位点较多而无法被正确比对（图 3a）。接着，HISAT 根据第一遍的比对结果识别并收集剪接位点位置。然后，第二遍运行 HISAT，完成对第 4 类 reads 的比对（图 3b，Junction extension）。

fig 3

图 3 HISAT 处理第 4 类 reads

涉及假基因 reads 的比对

加工后的假基因是原始基因转录、去除内含子并重新插入到基因组不同位置的非功能性副本。假基因与原始基因非常相似，reads 可能同时比对到假基因及原始基因上。图 4 展示了 1 号染色体上两个外显子在 17 号染色体上有几乎完全相同的副本（仅存在一个碱基差异）。因此，原本跨越染色体 1 上两个外显子的 reads 可能被错误地比对到 17 号染色体。由于 reads 比对到 17 号染色体会产生一个错配，得分低于比对到 1 号染色体，HISAT 将仅输出 1 号染色体的比对位置。如果假基因与原始基因序列完全一致，比对结果得分相同，HISAT 将输出所有位置信息。

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图 4 HISAT 处理涉及假基因的 reads

HISAT 比对的速度、精度及内存占用情况

HISAT 的作者从人类基因组 GRCh37 中随机选择 17,647 个转录本，模拟生成 2000 万个长度为 100 bp 的 reads。不同软件的计算速度和准确度如图 5、6 所示。HISAT 速度最快，约是 STAR 的 1.5 倍，约是 TopHat2 的 62 倍。HISAT 精度最高，略高于 TopHat2，高于 STAR 等软件。另外，HISAT 作者还比较了不同软件比对 109 million reads 的肺成纤维细胞 RNA-seq 数据。结果显示，HISAT 的内存消耗远小于 STAR（图 7）。值得注意的是，第三方的检测结果中 HISAT 的表现并没有这么优秀，参见 https://www.nature.com/articles/s41467-017-00050-4。

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